两性霉素B处理人脐带间充质干细胞的培养与分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.28.009

摘要/Abstract

摘要：

背景：建立和完善避免真菌污染的方法，有效降低采集脐带时分离培养的污染率，以便获得优质高效的脐带间充质干细胞。
目的：探讨两性霉素B对脐带间充质干细胞的生长状态及分化潜能的影响。
方法：采用胶原酶消化法从正常顺产足月新生儿脐带中分离出间充质干细胞，经两性霉素B处理，用MesenPRO RS™培养基进行体外扩增培养。取对数生长期的第3代脐带间充质干细胞，分析其形态、增殖方式和免疫表型，在体外诱导其向成骨和脂肪细胞分化。
结果与结论：经两性霉素B处理后，在体外仍能成功分离培养出脐带间充质干细胞。流式细胞术结果显示，人脐带间充质干细胞仍强表达CD44，CD105，CD73，CD90，阴性表达HLA-DR，CD29，CD31，CD34。两性霉素B处理后的人脐带间充质干细胞经体外诱导能向脂肪和成骨细胞分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 脐带脐血干细胞, 两性霉素B, 脐带, 间充质干细胞, 真菌, 诱导分化, 成骨细胞, 脂肪细胞, 干性

Abstract:

BACKGROUND: High-quality and efficient umbilical cord-derived mesenchymal stem cells could be obtained by establishing and improving the method to avoid fungal contamination and by effectively decreasing pollution rate of isolated culture during umbilical cord collection.
OBJECTIVE: To explore the effects of amphotericin B on growth and differentiation potential of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells.
METHODS: Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells were separated from healthy full-termed delivery fetus using collagenase digestion method and treated with amphotericin B. Subsequently, umbilical cord-derived mesenchymal stem cells were amplified and cultured in vitro with MesenPRO RSTM medium. The third passage of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells in logarithmic phase was obtained to analyze their morphology, proliferation and immunophenotype, and induced to differentiate into osteoblasts and adipocytes in vitro.
RESULTS AND CONCLUSION: After treatment with amphotericin B, umbilical cord-derived mesenchymal stem cells were successfully isolated and cultured in vitro. Flow cytometry results revealed that human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells strongly expressed CD44, CD105 and CD73, CD90, and negatively expressed HLA-DR, CD29, CD31, and CD34. Amphotericin B-treated human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells can still differentiate into adipocytes and osteoblasts in vitro.

全文链接：

Key words: umbilical cord, mesenchymal stem cells, amphotericin B, fungi

中图分类号:

R394.2

黄文敬，刘俊江，周建宇，洪敬欣，李茜，韩俊领.. 两性霉素B处理人脐带间充质干细胞的培养与分化[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(28): 4479-4484.

Huang Wen-jing, Liu Jun-jiang, Zhou Jian-yu, Hong Jing-xin, Li Qian, Han Jun-ling. Cultivation and differentiation of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells treated with amphotericin B[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(28): 4479-4484.

图/表（结果） 6

2.1 实验组和对照组细胞形态学观察经7-10 d原代培养，观察到有短杆状，梭型细胞呈漩涡状生长。用培养液进行传代培养，呈漩涡状集落生长。两组细胞形态上无明显差别(图1)。

2.2 实验组和对照组细胞生长曲线增殖特点连续观察20份实验组和对照组脐带间充质干细胞的增殖情况，经统计学分析，两者差异无显著性意义(P > 0.05)(图2)。两性霉素对细胞有一定的毒性，但在安全范围内可以作为实验中抑制真菌污染的防范措施。

2.3 人脐带间充质干细胞免疫表型鉴定流式细胞仪检测结果显示，实验组人脐带间充质干细胞仍能强表达CD44，CD105，CD73，CD90，阳性率分别100%，84.57%，99.23%，100%(图3)；阴性表达HLA-DR，CD29，CD31，CD34，阳性率分别为0.08%，0.21%，0.04%，0.16%(图4)。

2.4 人脐带间充质干细胞的成脂分化潜能实验组成脂诱导后的人脐带间充质干细胞，其形态由典型的长梭形逐渐变短、变胖，呈圆形或椭圆形。诱导7-10 d后，光镜下可见折光性很强的小空泡，提示有脂滴开始形成。诱导 21 d后油红O染色，可见胞浆中有大量被染成的红色的小脂滴(图5)。对照组诱导21 d，经油红O染色后也形成红色小脂滴，两组无明显差别。

2.5 人脐带间充质干细胞的成骨分化潜能实验组人脐带间充质干细胞成骨诱导2周后，由梭形逐渐变为多边形，出现相互聚集的倾向。诱导28 d后茜素红染色可见立方形，多边形细胞的胞质被染成红褐色，为阳性反应(图6)。对照组细胞成骨诱导28 d，茜素红染色胞质也被染成红褐色，两组无差别。

参考文献

[1]Friedenstein AJ, Deriglasova UF, Kulagina NN,et al. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method.Exp Hematol. 1974;2(2):83-92.
[2]Deans RJ, Moseley AB.Mesenchymal stem cells: biology and potential clinical uses.Exp Hematol. 2000;28(8):875-884.
[3]Minguell JJ, Conget P, Erices A.Biology and clinical utilization of mesenchymal progenitor cells.Braz J Med Biol Res. 2000; 33(8):881-887.
[4]Quesenberry PJ, Abedi M, Aliotta J,et al.Stem cell plasticity: an overview.Blood Cells Mol Dis. 2004;32(1):1-4.
[5]Nöth U, Osyczka AM, Tuli R,et al.Multilineage mesenchymal differentiation potential of human trabecular bone-derived cells.J Orthop Res. 2002;20(5):1060-1069.
[6]Rogers I, Casper RF.Umbilical cord blood stem cells.Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 2004;18(6):893-908.
[7]Zvaifler NJ, Marinova-Mutafchieva L, Adams G,et al. Mesenchymal precursor cells in the blood of normal individuals. Arthritis Res. 2000;2(6):477-488.
[8]Le Blanc K, Rasmusson I, Sundberg B,et al. Treatment of severe acute graft-versus-host disease with third party haploidentical mesenchymal stem cells.Lancet. 2004;363 (9419):1439-1441.
[9]Kassem M, Abdallah BM.Human bone-marrow-derived mesenchymal stem cells: biological characteristics and potential role in therapy of degenerative diseases.Cell Tissue Res. 2008;331(1):157-163.
[10]Nakamizo A, Marini F, Amano T,et al.Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in the treatment of gliomas.Cancer Res. 2005;65(8):3307-3318.
[11]张学锋,张美荣,胡剑霞,等.异种脐带间充质干细胞静脉应用的安全性[J].中国组织工程研究与临床康复,2010,14(32): 5971- 5975.
[12]Sobolewski K, Bańkowski E, Chyczewski L,et al.Collagen and glycosaminoglycans of Wharton's jelly.Biol Neonate. 1997; 71(1):11-21.
[13]Secco M, Zucconi E, Vieira NM,et al.Multipotent stem cells from umbilical cord: cord is richer than blood.Stem Cells. 2008; 26(1):146-150.
[14]Wexler SA, Donaldson C, Denning-Kendall P,et al.Adult bone marrow is a rich source of human mesenchymal 'stem' cells but umbilical cord and mobilized adult blood are not.Br J Haematol. 2003;121(2):368-374.
[15]Romanov YA, Svintsitskaya VA, Smirnov VN.Searching for alternative sources of postnatal human mesenchymal stem cells: candidate MSC-like cells from umbilical cord.Stem Cells. 2003;21(1):105-110.
[16]Seshareddy K, Troyer D, Weiss ML.Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton's Jelly of umbilical cord.Methods Cell Biol. 2008;86:101-119.
[17]Wang HS, Hung SC, Peng ST,et al.Mesenchymal stem cells in the Wharton's jelly of the human umbilical cord.Stem Cells. 2004;22(7):1330-1337.
[18]Karahuseyinoglu S, Cinar O, Kilic E,et al.Biology of stem cells in human umbilical cord stroma: in situ and in vitro surveys. Stem Cells. 2007;25(2):319-331.
[19]Sarugaser R, Lickorish D, Baksh D,et al.Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: a source of mesenchymal progenitors.Stem Cells. 2005;23(2):220-229.
[20]Baksh D, Yao R, Tuan RS.Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow.Stem Cells. 2007;25(6):1384-1392.
[21]Chen MY, Lie PC, Li ZL,et al.Endothelial differentiation of Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells in comparison with bone marrow-derived mesenchymal stem cells.Exp Hematol. 2009;37(5):629-640.
[22]Mitchell KE, Weiss ML, Mitchell BM,et al.Matrix cells from Wharton's jelly form neurons and glia.Stem Cells. 2003; 21(1):50-60.
[23]杨军凤.妊娠期外阴阴道念珠菌感染患者的临床治疗[J].世界最新医学信息文摘:电子版,2012,12(6):100-101.
[24]任保艳,杨文勇.真菌性阴道炎患者菌种分布及耐药性分析[J].医学理论与实践,2011,24(1):67-68.
[25]赵林,申延清,荣春,等.间充质干细胞培养与分化诱导的特点及机制[J].中国组织工程研究与临床康复,2010,14(40):7551-7554.
[26]Stenderup K, Justesen J, Clausen C,et al.Aging is associated with decreased maximal life span and accelerated senescence of bone marrow stromal cells.Bone. 2003;33(6): 919-926.
[27]Mueller SM, Glowacki J.Age-related decline in the osteogenic potential of human bone marrow cells cultured in three-dimensional collagen sponges.J Cell Biochem. 2001; 82(4):583-590.
[28]祝加学,沈尊礼,秦金保,等.一种大量快速分离脐带间充质干细胞的新方法[J].现代生物医学进展,2010,10(6):1164-1169.
[29]Heino TJ, Hentunen TA.Differentiation of osteoblasts and osteocytes from mesenchymal stem cells.Curr Stem Cell Res Ther. 2008;3(2):131-145.
[30]Ma L, Feng XY, Cui BL,et al.Human umbilical cord Wharton's Jelly-derived mesenchymal stem cells differentiation into nerve-like cells.Chin Med J (Engl). 2005;118(23):1987-1993.
[31]郭艳萍,李强,张爱君,等.人脐带间充质干细胞的培养及成骨诱导分化[J].中华实验外科杂志,2014,31(3):683.
[32]陈妍,潘丽杰,袁杰,等.冻存脐带间充质干细胞向成骨细胞的分化[J].中国组织工程研究,2013,17(36):6436-6442.
[33]洪敬欣,刘剑,李琳芳,等.地塞米松浓度与脐带间充质干细胞的成骨分化[J].中国组织工程研究,2013,17(23):4204-4211.
[34]汪涛,林晓波,杨丽娜,等.人脐带间充质干细胞向心肌细胞诱导分化并体内移植的研究[J].中国现代医生,2013,51(11):1-4.
[35]仇普斌,刘超,李伟,等.诱导人脐带间充质干细胞向心肌细胞分化及对小鼠心肌梗死的治疗作用[J].中国实验动物学报,2012, 20(5):9-14.
[36]阮中宝,杨向军,陈各才,等.体外培养和诱导人脐带源间充质干细胞定向分化为心肌细胞的实验研究[J].山东医药,2011,51(41): 64-65.
[37]王卫民,丁妍.BHA诱导人脐带间充质干细胞分化为神经细胞[J].东南大学学报:医学版, 2013,32(2):201-205.
[38]陈有,冯世庆,吴秋丽,等.人雪旺细胞促进人脐带间充质干细胞向神经方向分化的研究[J].中华实验外科杂志,2012,29(5): 930-932.
[39]王宪英,吴红海,秦亚斌,等.脑组织匀浆诱导人脐带间充质干细胞分化为神经样细胞[J].中国老年学杂志,2012,32(7):1439-1441.
[40]李振勇,李明,卢国辉,等.脐带间充质干细胞的分离培养及诱导分化为多巴胺能样神经元[J].中华神经医学杂志,2011,10(3): 241-245.
[41]毛希宏,杨智勇,孟明耀,等.人脐带间充质干细胞的培养鉴定及其向神经元细胞分化的研究[J].昆明医学院学报,2011,32(1): 41-47.
[42]禹亚彬,陈维,卞建民,等.体外定向诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛样细胞[J].中国组织工程研究,2013,17(6):1012-1017.
[43]陈桃,王云帅,谷乐辉,等.胰岛新生相关蛋白肽在促进脐带间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞中的作用[J].细胞与分子免疫学杂志,2013,29(2):141-145.
[44]李世龙,刘毅,惠玲,等.携带人胰岛素基因腺病毒载体转染人脐带间充质干细胞及其成脂分化[J].中国组织工程研究,2013,17(6): 999-1003.

引言

间充质干细胞是目前备受关注的一类具有多向分化潜能的成体干细胞，是多能干细胞家族的重要成员，其来源于发育早期的中胚层和外胚层，体外可大量扩增，具有多向分化潜能，并可参与免疫调节反应。间充质干细胞能分化为成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞等间质组织细胞^[1-3]，甚至能分化为心肌细胞、神经胶质细胞和神经细胞^[4-7]。间充质干细胞广泛分布在体内骨髓和其他组织与器官中，如脂肪组织、脐血，甚至在外周血也发现有间充质干细胞^[4-7]。除了具有多向分化潜能外，间充质干细胞还具有低免疫原性和组织归巢能力，使其成为治疗组织损伤、组织变性、自身免疫性疾病的理想选择^[8-10]。且前期临床研究认为脐带间充质干细胞静脉注射是安全的^[11]。骨髓间充质干细胞数量和分化潜能随年龄的增长而减少，取材易对身体造成伤害；而脐带是由中胚层发育而来，是胎儿时期连接胎儿和母体的索状结构，内有2条动脉和1条静脉及血管周围富含蛋白多糖和黏多糖组织组成^[12]。由于脐血中间充质干细胞数量尚存争议^[13-14]，而从脐带中分离出的间充质干细胞具有明显的优越性^[15-21]。间充质干细胞自Mitchell等^[22]提出人脐带沃顿胶来源的间充质具有多能干细胞的特性后，越来越多的研究集中在该领域。妊娠期妇女雌激素水平升高，使阴道的酸度增高，菌群失调，免疫力降低，有利于念珠菌的生长，是常见的妊娠合并症。由于顺产产妇携带外阴阴道念珠菌，在脐带分离和培养时可能会遇到真菌污染。孕妇外阴阴道念珠菌的发病率为12.7%(127/1 000)^[23]。临床分离菌以白色念珠菌居多(69.8%)，其次为光滑念珠菌(18.8%)，较少的有热带念珠菌(5.2%)与克柔念珠菌(4.2%)，偶见新型隐球酵母菌及酿酒酵母菌(各占1% )。药物敏感试验显示：制霉菌素、两性霉素B的敏感性均在90%以上，制霉菌素与两性霉素B对真菌的敏感性较好^[24]。鞘内或静脉滴注给药时可取5 g/L的药液1 mL，加5%葡萄糖注射液 19 mL稀释，使最终质量浓度成25 mg/L。因此本实验在采集和培养脐带间充质干细胞过程中，加入两性霉素B，观察脐带间充质干细胞是否还保持良好的生长状态及分化潜能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
全文链接：

材料方法

设计：细胞学体外观察实验。

时间及地点：实验于2013年5至12月在天津市协和干细胞基因工程有限公司完成。

材料：新鲜脐带标本20份来自脐带公共库，采集足月妊娠健康新生儿脐带，均经产妇授权同意，且产妇母血标本检测病毒5项，即HIV，CMV，HBSAg，梅毒，HCV检测均为阴性。标本采集后置于4 ℃冰箱内保存，12 h以内待处理。

实验方法：

人脐带间充质干细胞的分离与培养：在无菌的条件下将每份脐带用生理盐水充分洗涤，在超净台内，分成实验组和对照组，分别剪成5 cm长的小段，血管剥离，移至0.1%的胶原酶Ⅱ的消化液中，37 ℃振荡，充分消化6 h，用200目滤网过滤，滤液用DMEMF/12充分洗涤2次，用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养液，分别按1×10⁶/cm²接种于25T培养瓶。实验组和对照组每3-5 d换液进行原代培养，去除未贴壁细胞，对照组继续用含体积分数为10%胎牛血清的培养液培养，而实验组体积分数为10%的胎牛血清原代培养液中加入两性霉素B 100 μL，抑制其真菌生长。待实验组和对照组细胞的融合度到达80%后，用2.5%的胰酶消化，按1∶3的比例传代培养，对照组传至75T培养瓶继续培养；而实验组传代后继续向培养液中加入100 μL两性霉素B。倒置相差显微镜观察两组细胞形态和细胞融合度。

细胞增殖情况的观察：分别取实验组和对照组对数生长期的第3代细胞，用0.25%的胰酶消化，PBS洗涤3次，取2×10⁷接种于96孔板，每天取4孔细胞用MTT法检测活细胞数，连续培养8 d。以培养时间(d)为横轴，570 nm吸光度值(A)为纵轴，绘制生长曲线。

流式细胞仪免疫表型的检测：取实验组和对照组处于对数生长期的第3代细胞，用Typle消化，PBS分别洗涤3次，PBS混悬。流式细胞仪检测两组细胞表面抗原CD44，CD105，CD73，CD90，HLA-DR，CD29，CD31，CD34的表达情况。

成脂细胞诱导分化：实验组取第3代脐带间充质干细胞按1×10⁴接种于6孔板中，用MesenPRO RS^TM medium和体积分数为10%的胎牛血清培养，加入两性霉素B 100 μL，至80%融合时加入成脂诱导液(10 mg/L地塞米松，100 μg/L吲哚美辛，0.5 mmol/L 1-甲基-3-异丁基黄嘌呤)。对照组取第3代脐带间充质干细胞按1×10⁴接种于6孔板中，用MesenPRO RS^TM medium和体积分数为10%的胎牛血清培养，至80%融合时加入成脂诱导液(10 mg/L地塞米松，100 μg/L吲哚美辛，0.5 mmol/L 1-甲基-3-异丁基黄嘌呤)。阴性对照组用MesenPRO RS^TM medium和体积分数为10%的胎牛血清培养，四五天换液1次，不加诱导液，连续诱导14 d，PBS洗2次，多聚甲醛固定10 min，油红O染色30 min，蒸馏水冲洗，自然晾干后中性树脂封固。

成骨细胞诱导分化：实验组取第3代脐带间充质干细胞按1×10⁴接种于6孔板中，用MesenPRO RS^TM medium和体积分数为10%的胎牛血清培养，加入两性霉素B 100 μL，培养到细胞80%融合，用PBS无菌洗涤细胞2次，加入成骨诱导分化液(100 nmol/L地塞米松，10 mmol/L β-甘油磷酸钠，0.2 mmol/L抗坏血酸)。对照组不加两性霉素B，其他同上，阴性对照组用MesenPRO RS^TM medium和体积分数为10%的胎牛血清培养，四五天换液1次，不加诱导液，连续诱导4周，显微镜下观察黑色不透明区域，PBS洗2次，80%丙酮固定10 min，用茜素红染色检测钙结节。

主要观察指标： ①倒置显微镜观察细胞形态。②实验组和对照组人脐带间充质干细胞增殖情况。③流式细胞仪检测实验组和对照组人脐带间充质干细胞表型。④实验组和对照组成脂成骨诱导分化能力。

统计学分析：所有数据以x(_)±s表示，用SPSS 13.0软件进行统计学分析，采用One-wayANOVA方差分析，P > 0.05为差异无显著性意义。统计学处理由第一作者完成。

全文链接：

讨论

近年来关于干细胞移植治疗的基础研究和临床应用已经成为世界研究的热点课题，但如何成功应用于临床，解决棘手的医疗疾病，仍有大量的问题有待解决：如何获取大量的间充质干细胞，同时维持其不分化的状态，如何避免各种病原体的污染，在干细胞的整个发育过程中哪个阶段的干细胞最适合做移植，如何减少或避免免疫排斥反应等等^[25]。随着年龄的老化，骨髓源间充质干细胞的数量及分化潜能显著下降^[26-27]。从脐带中获取间充质干细胞，具有来源广泛，取材简单方便，病毒感染概率小，分化潜能强，免疫原性低，转染效率高等优点。实验采用酶消化法获得脐带间充质干细胞，培养7-10 d形成漩涡状细胞集落，第3代细胞生长速度明显增快，实验组和对照组在细胞增殖方面无显著性差异。两性霉素B是一类多烯类抗真菌药，将其作为一种抗真菌、抗酵母菌以及抗霉菌制剂加入细胞培养液中使用，通常的有效浓度是25 mg/L，在30 mg/L时有细胞毒性，通过实验表明，加入两性霉素B的实验组间充质干细胞的细胞增殖能力比不加入两性霉素B的对照组在细胞增殖期稍有下降，但不影响细胞整体的增殖能力。免疫表型分析实验组间充质干细胞仍能强表达CD44，CD105，CD73，CD90，阴性表达HLA-DR，CD29，CD31，CD34。实验组经成骨诱导后，通过茜素红染色证实加入两性霉素B培养基培养的间充质干细胞可以分化为成骨细胞；同样经成脂诱导后，经过油红O染色，实验组能观察到红色油滴，说明合理的两性霉素B浓度对间充质干细胞的体外诱导分化并未产生影响。根据国际细胞治疗委员会的规定，鉴定间充质干细胞必须满足3条才可以被认为是间充质干细胞。首先细胞必须是贴壁生长，其次间充质干细胞必须表达CD90、CD105、CD73等间充质干细胞的特异性标记，而不表达造血系或内皮系细胞的标记CD45、CD34、CD14、CD19及主要组织相容性抗原HLA-DR^[28]；再次，必须具有分化为骨、软骨、脂肪细胞的多向分化潜能。由于没有鉴定人脐带间充质干细胞的特异表面抗原，其向多种间质组织细胞如脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞诱导分化的多向潜能被认为是最有力的证据。本实验中实验组和对照组的细胞可定向诱导分化为脂肪和成骨细胞^[29]。结果发现，加入含两性霉素B的培养基的实验组干细胞不仅能够贴壁生长，具有很好的增殖能力，而且强表达间充质干细胞的特异性表面标记而不表达造血系和内皮系细胞的标记，主要组织相容性抗原也是阴性。

通过实验研究表明，在培养基中加入适量的两性霉素B可以有效的降低采集脐带分离培养的污染率，并不影响脐带间充质干细胞的增殖和干性表达，可以作为脐带分离和培养的良好的防治措施之一，但是还存着一些问题有待解决，例如两性霉素B可应用于细胞培养污染的防范，针对于其他的污染源要采取何种方法加以预防，加入抗生素的细胞能否在安全范围内应用于细胞治疗和移植，如果可以，这个安全范围应该是多少，这些问题还需要进一步深入研究和探讨。

总之，人脐带来源的间充质干细胞来源广泛、获取容易，免疫原性低，分化增殖能力强，恰当的人脐带来源的间充质干细胞培养方法可以快速高效的获得大量的种子细胞，并可在一定的诱导条件下向成骨、心肌样、神经元样、胰岛样、脂肪样细胞分化^[30-44]。为细胞种子库贮备了大量具有潜力的种子细胞，为未来各系统疾病的治疗及基因治疗奠定了良好的基础，是人类医学未来的发展方向。